일본 이화학연구소(RIKEn)는 살아있는 세포 안에서 거대한 결정을 순간적으로 형성하는 형광단백질 ‘Xpa(Crystalizable and photo-activatable)’를 발견하였다. 또한 Xpa 단백질의 결정이 세포의 자가포식작용(autophagy)에 관련된 세포 소기관 리소좀의 막을 둘러싸여 격리되는 과정을 해명하였다.

일반적으로 단백질 결정을 제작하기 위해서는 단백질 순도와 농도가 높은 수용액을 정치시켜 큰 결정을 얻을 수 있다. 하지만 살아있는 세포의 경우 세포질에서 비정상적으로 많은 종류의 분자가 끊임없이 움직이기 때문에 단백질 농도가 높더라도 결정의 형성이 일어나기 어렵다.

연구진은 2002년 오키나와에서 채취한 뇌산호(Faviidae)에서 적색 형광단백질 ‘KikG’의 유전자를 채취하였다. 그 후 2005년 KikG에 아미노산 변이체를 도입하여 적외선을 받으면 녹색이 적색으로 변하는 형광단백질 ‘KikGR’을 제작하여 발표하였다. 이번 연구에서는 KikGR에 아미노산 변이를 도입한 실험과정에서 어느 개변체가 세포 내에서 결정화하는 현상을 발견하여 이를 Xpa(Crystalizable and photo-activatable)라고 명명하였다. (Xpa의 X는 결정, pa는 빛에 의한 색의 변환을 의미한다.) 이 단백질이 세포 내에서 결정화되는 과정과 그 이후의 운명은 지금까지 밝혀지지 않아, 연구진은 이를 해명하고자 하였다.

연구진은 Xpa단백질의 유전자를 통상 배양세포(HEK293: 포유류세포)에 도입하여 세포질 내에서 가능한 Xpa단백질 결정을 관찰하였다. 그 결과 어느 비율의 세포에서 결정이 마름모꼴로 수 micron사이즈로 성장하였다. 또한 유전자 도입 후 배양세포를 일정시간 간격으로 정지화상을 촬영하고 이를 연결하여 편집하는 타임랩스 이미징으로 관찰한 결과, 결정이 현저히 빠른 속도로 성장한다는 것을 확인하였다. 이는 결정의 핵이 형성됨과 동시에 세포질에 존재하는 거의 대부분의 Xpa 단백질이 순식간에 집합하여 결정이 완성되는 것으로 추측된다. 또한 투과형 전자현미경으로 관찰하면 결정 내에 Xpa단백질의 다량체 구조가 규칙적으로 정렬되어 있는 것을 확인할 수 있다. 또한 결정의 주변에 주목하면 결정이 지방막으로 뒤덮여있는 것으로 확인할 수 있었으며, 이 지방막의 유래 및 실체를 면역조직화학법으로 조사한 결과 리소좀막인 것을 확인하였다.

리소좀은 세포 내의 불필요한 단백질을 분해하는 메커니즘(자가포식작용)을 담당하는 세포 소기관이다. 자가포식작용에는 2종류가 있어, 하나는 생체의 불필요한 고분자와 세포기관을 대규모, 비선택적으로 분해하는 ‘비선택적 자가포식작용’과 다른 하나는 유비퀴틴, p62, LC3과 같은 특정한 목적을 표적으로 한 단백질을 선택적으로 분해하는 ‘선택적 자가포식작용’이다. Xpa 단백질의 결정과 같은 큰 구조물의 경우 비선택적 자가포식작용에 의해 처리되지 않는다고 생각되었으나, 면역조직학 실험을 통해 해석한 결과 유비퀴틴, p62, LC3이 표적이 된다는 것을 확인하였다. 이를 통해 Xpa단백질이 선택적 자가소화작용으로 처리된다는 것을 확인하였다. 이어 Xpa단백질의 세포 내 결정 생성에 대해 실험하였다. Xpa단백질의 결정이 최종적으로 리소좀내에 존재하는 것에 대해서 2가지 가설을 세울 수 있었다. 첫 번째는 Xpa단백질이 리소좀 내에 농축되어 결정화된 후 그 상태로 리소좀 내에 존재한다는 것이며, 다른 하나는 Xpa 단백질이 세포질 내에 결정화된 후 자가포식 리소좀의 막구조에 둘러싸여 최종적으로 리소좀 내에 존재한다는 것이다. 이 가설을 검증하기 위해서는 리소좀의 성숙을 저해하는 약제를 세포에 추가하여 Xpa단백질의 결정화를 관찰하였다. 그 결과 리소좀의 성숙을 저해하는 것에 관계없이 세포질 내에 큰 Xpa 단백질 결정이 확인되어 두 번째 가설이 맞다는 것을 확인하였다. 이상의 결과를 통해 Xpa단백질은 세포질 내에 결정화 되어 그 후 ‘선택적으로’ 자가포식 리소좀에 둘러싸여 리소좀의 공간 속으로 이동한다는 것을 확인하였다. 또한 Xpa 단백질의 결정이 존재하는 세포 1개를 동결 시료로 제작하여 대형방사광시설 ‘Spring-8’에서 X선 회절구조해석을 수행한 결과 해석가능한 회절 패턴을 얻어 2.9 A분해능에서 Xpa단백질의 입체구조를 결정하였다.

본 연구를 통해 단백질 결정에 대한 세포 내 응답에 관한 새로운 사실을 확인할 수 있었다. 세포질 내에서 만들어진 단백질 결정이 선택적 자가포식에 의해 막에 격리된다는 사실이다. 이를 통해 세포 내에 발현하는 결정을 더욱 깊이 이해할 수 있었다. 세포내 결정은 천연 물질에도 존재하지만, 일반적으로는 매우 희귀한 현상이다. Xpa 단백질의 결정은 형광이기 때문에 쉽게 발견할 수 있었지만, 일반적으로 형광을 발하지 않는 단백질 결정은 발견하기 어렵기 때문에 실제로는 더 많은 단백질의 결정화가 일어나고 있다고 볼 수 있다. 향후 형광 외의 단백질에 대해서도 검출기법을 개발하고 이를 활용한다면 세포내 단백질 결정에 관한 보다 포괄적인 해석을 할 수 있다. 또한 본 결정은 향후 알츠하이머의 아밀로이드반이나 프리온병에 관련된 프리온 응집체 등을 해석하는데 기여할 것으로 기대된다.

한편 결정의 생성과정은 (1)핵형성과 (2)성장으로 나뉠 수 있으며, 연구진은 Xpa단백질의 결정 성장이 매우 빠른 것을 보여주었다. 이후 성장과정을 보다 높은 시간분해능으로 관찰하여 세포 내의 동정활동 중에서 일어나는 규칙적인 분자집합의 실태를 확인하고자 한다. 한편 Xpa단백질의 결정의 핵형성에 대해서는 해명되지 않는 부분이 많다. 핵 형성의 메커니즘을 알게 된다면, Xpa단백질의 결정을 시공간적으로 제어할 수 있는 기술을 개발할 수 있게 될 것이다.

또한 X선 구조해석을 위해서는 깔끔한 단백질 결정이 필요하며, 결정화되기 어려운 단백질이 Xpa단백질과의 융합을 통해 결정화하기 쉽게 된다면 이를 구조생물학에서도 유용하게 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

본 연구성과는 Molecular Cell지에 게재된 논문 "A diffraction-quality protein crystal processed as an autophagic cargo”에서 확인할 수 있다.